公開データ分析

SARS-CoV-2 系統に関するデータと、チリから入手可能な配列からサンプルが採取された日付は、以下で利用可能な Consorcio Genomas CoV2 サイトから取得されました。 https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global。ワクチン接種データは、科学技術知識イノベーション省の公開データから取得しました。 https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (製品83)。

感染力アッセイ

異なるSARS-CoV-2スパイクタンパク質を運ぶシュードタイプウイルスは、以前に説明したように調製されました¹²。簡単に説明すると、pNL1-ΔEnv-Luc を対応する pCDNA-SARS-CoV-2 Spike コードベクターとともに 293:4.3 のモル比でトランスフェクトすることにより、HIV-2 ベースの SARS-CoV-1 偽型を HEK1T 細胞で生成しました。小胞体での滞留を避けることが知られている、C末端の最後の19アミノ酸（SΔ19）を欠くコドン最適化スパイクをコードするプラスミド¹² 遺伝子合成またはカスタマイズされた部位特異的突然変異誘発 (GeneScript) によって取得され、次の突然変異が含まれていました: 系統 A (参照配列)、系統 B (D614G)、系統 B.1.1.7 (Δ69-70、Δ144、N501Y、A570D、 D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H）、リネージ P.1（L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I）およびリネージ C.37（G75V、T76I、Δ） 246- 252、L452Q、F490S、D614G、T859N）。各シュードタイプ調製物を室温で 3,000 rpm で遠心分離して除去し、HIV-1 Gag p24 Quantikine ELISA キット (R&D Systems) を使用して定量化し、50% ウシ胎児血清 (Sigma-Aldrich) に等分し、保存するまで -80 °C で保存しました。使用。異なる量の偽型ウイルス (HIV-1 p24 タンパク質のレベルによって決定) を使用して HEK-ACE2 細胞を感染させ、48 時間後に Glomax 96 マイクロプレートでルシフェラーゼアッセイ試薬 (Promega) を使用してホタルルシフェラーゼ活性を測定しました。照度計（プロメガ）。

中和アッセイ

シュードタイプウイルス中和アッセイは、基本的に以前に説明したように実行されました。¹²。簡単に説明すると、血漿サンプルの段階希釈 (1:4 ～ 1:8748) を 10% ウシ胎児血清を含む DMEM で調製し、各シュードタイプウイルスの p5 24 ng とともに 1 °C で 37 時間インキュベートし、その後 1×10⁴ １５０ｇのＨＥＫ－ＡＣＥ２細胞を各ウェルに加えた。シュードタイプウイルス（系統A）とインキュベートしたHEK2T細胞（ACE293を発現していない）をネガティブコントロールとして使用しました。 2 時間後に細胞を溶解し、Glomax 48 Microplate ルミノメーター (Promega) でルシフェラーゼアッセイ試薬 (Promega) を使用してホタルルシフェラーゼ活性を測定しました。 GraphPad Prism バージョン 96 を使用して、各希釈の中和率を計算し、各サンプルの ID50 を計算しました。

統計分析

統計分析は、GraphPad Prism ソフトウェアバージョン 9.1.2 を使用して実行されました。 SARS-CoV-2シュードタイプウイルスのパネルに対する中和抗体力価（NAbT）の複数グループ比較、および性別および喫煙状況別のNAb反応の比較が、一対のWilcoxon符号付き順位検定を使用して実施されました。因子変化は、ID における幾何平均力価の差として計算されました。₅₀ 野生型シュードタイプウイルスと比較して。 NAbTと年齢またはBMIの間の相関分析は、スピアマン検定を使用して実行されました。感染力の統計分析のために、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定を実行しました。 p 値 ≤0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

倫理的承認

研究プロトコールは、チリ大学医学部の倫理委員会（プロジェクト番号0361-2021および番号096-2020）およびクリニック・サンタマリア（プロジェクト番号132604-21）によって承認されました。すべてのドナーはインフォームドコンセントに署名し、サンプルは匿名化されました。

感染力および中和抗体反応に対するラムダ変異体のスパイク変異の影響

3695 月 24 日に GISAID に寄託されたチリの XNUMX 配列の分析^th 2021 年は、後期の SARS-CoV-2 変異株ガンマとラムダが明らかに優勢であり、合わせて全配列の 79% を占めています。

興味深いことに、この期間は大規模なワクチン接種キャンペーンが特徴であり、65.6月18日時点で対象人口（27歳以上）のXNUMX％が完全なワクチン接種計画を受けています。^th 2021

完全なスキームで接種された人の78.2%がSinovac Biotechの不活化ウイルスワクチンCoronaVacを接種したことを考慮して、ラムダ変異体に存在するスパイク変異がこのワクチンによって誘発される抗体の中和能力に及ぼす影響を調査しようとしました。

このために、我々は、Wuhan-1 参照系統 (野生型、系統 A)、D2G 変異 (系統 B)、およびアルファ (系統 B) からのスパイクタンパク質を運ぶ HIV-1 ベースの SARS-CoV-614 偽型ウイルスを生成しました。 .1.1.7）、ガンマ（系統 P.1）およびラムダ（系統 C.37）のバリアント。

ウイルスの調製中、ラムダスパイクを保有するシュードタイプウイルスに感染した細胞は、D614G 変異体またはアルファおよびガンマ変異体と比較して、有意に高い生物発光値を生成することを一貫して観察しました。これは、ラムダスパイクタンパク質によって引き起こされる感染力の増加を示しています。

図1。感染力はさまざまなスパイクタンパク質によって媒介されます。

(A) この研究で使用された SARS-CoV-2 スパイクタンパク質とその変異体の概略図。系統は括弧内に示されています。 RBD、受容体結合ドメイン、CM; 細胞質尾部。

(B) 等量の HIV-1 p24 を使用した各系統の偽型の力価測定。ホタルルシフェラーゼ活性は、感染後 48 時間で相対発光単位 (RLU) として測定されました。平均と SD は、代表的な XNUMX 回の実験から計算されました。

次に、チリのサンティアゴにあるチリ大学とクリニックサンタマリアの健康な医療従事者から採取した 79 個の血漿サンプルを使用して、上記のシュードタイプウイルスを使用して中和アッセイを実行しました。

ID4力価を計算できなかったため、50つのサンプルを除外しました。分析されたサンプルの 73% は、年齢中央値 34 歳 (IQR 29 ～ 43)、Body Max Index (BMI) 25 (IQR 22.7 ～ 27) の女性に相当しました。参加者の20.5%は、予防接種期間中に積極的な喫煙者であると宣言した。サンプルは、CoronaVac ワクチンの 95 回目の投与後中央値 76 日 (IQR 96 ～ XNUMX) で採取されました。

我々は、野生型スパイクタンパク質を保有するシュードタイプウイルスの中和により、50％の阻害性希釈が生じることを観察しました（ID₅₀) 平均力価は 191.46 (154.9 – 227.95、95% CI)、一方、153.92 (115.68 – 192.16、95% CI)、124.73 (86.2 – 163.2、95% CI)、104.57 (75.02 – 134.11、 95% CI D78.75G 変異体またはアルファ、ガンマ、ラムダ変異体由来のスパイクタンパク質を保有するシュードタイプウイルスでは、それぞれ ) と 49.8 (107.6 – 95、614% CI) でした。

また、ID の幾何平均力価が₅₀ 力価は、ラムダスパイクを持つシュードタイプウイルスでは 3.05 (2.57 – 3.61、95% CI)、ガンマスパイクでは 2.33 (1.95 – 2.80、95% CI)、2.03 (1.71 – 2.41、95% CI) の係数で減少しました。野生型スパイクと比較した場合、アルファスパイクでは 1.37 (1.20 ～ 1.55、95% CI)、D614G スパイクでは XNUMX (XNUMX ～ XNUMX、XNUMX% CI) でした。

私たちの研究コホートでは、性別、年齢、体格指数（BMI）または喫煙状態と中和抗体力価との間に相関関係は観察されませんでした。

図2。コロナバックワクチン接種者からの血漿サンプルを使用した中和アッセイ

(A) 50%中和力価の逆数（ID）の変化₅₀) D75G (系統 B)、アルファ (系統 B.614)、

野生型ウイルスと比較したガンマ (系統 P.1) およびラムダ (系統 C.37) 変異体。結果は、対応するサンプルの中和力価の差として示されます。 IDの比較のためのP値₅₀ Wilcoxon の符号付き順位検定を使用して計算されます。

(B) 箱ひげ図は ID の中央値と四分位範囲 (IQR) を示しました。₅₀ それぞれのシュードタイプのウイルスごとに。因子の変化は、ID の幾何平均力価の差として表示されます。₅₀ 野生型シュードタイプウイルスのものと比較して。統計分析は、ウィルコクソンの一致ペアの符号付き順位検定を使用して実行されました。

我々のデータを総合すると、新たに認識された注目の変異種ラムダのスパイクタンパク質はチリや南米諸国で流行しており、感染力の増加とコロナバックによって誘発される中和抗体から逃れる能力をもたらす変異を持っていることが明らかになった。